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不同濃度的DLin在不同輔助磷脂DOPE和DOPC中的變化

更新時(shí)間:2021-12-16   點(diǎn)擊次數(shù):2231次

2020年12月9日,PCCP(phys.chem.chem.phys)期刊發(fā)表文章《DOPC versus DOPE as a helper lipid for gene-therapies: molecular dynamics simulations with DLin-MC3-DMA[1]。該文章使用分子模擬手段分析使用同一種陽(yáng)離子脂質(zhì)DLin-MC3-DMA與兩種不同的輔助磷脂(DOPC和DOPE)構(gòu)建兩種脂質(zhì)體體系進(jìn)行模擬。分析兩種合成磷脂形成的脂質(zhì)體差異。為將來(lái)理性化設(shè)計(jì)脂質(zhì)體提供可行性。

摘要:

可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)是基因治療遞送系統(tǒng)脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 的重要組成成分。 DLin-MC3-DMA 是有前途的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)(或胺脂質(zhì))之一。根據(jù)它們?cè)谒幬镏械膽?yīng)用,在包裹核酸的LNP中還包含各種輔助脂質(zhì),例如磷酸化和聚乙二醇化脂質(zhì)、膽醇等。由于其復(fù)雜的成分,這些基因療法中應(yīng)用的LNP結(jié)構(gòu)改進(jìn)較為困難,并且尚未確定每種脂質(zhì)在LNP的藥理作用。在這項(xiàng)工作中,構(gòu)建了DLin-MC3-DMA中性形式的原子模型,并進(jìn)行了全原子模型行下的分子動(dòng)力學(xué) (MD) 模擬,以研究LNP中合成磷脂頭部基團(tuán)對(duì)細(xì)胞膜可能存在的影響。在中性條件下( pH = 7.4)構(gòu)建并模擬了含有兩種不同摩爾比的 DLin-MC3-DMA(5%和15%)的DOPC及DOPE 脂質(zhì)的雙層。MD軌跡分析結(jié)果顯示DOPE脂質(zhì)頭部基團(tuán)與DLin-MC3-DMA尾部密切相關(guān),而DOPC脂質(zhì)的頭部基團(tuán)未觀察到這種顯著關(guān)聯(lián)。此外,DOPE和DLin-MC3-DMA之間較強(qiáng)的聯(lián)系導(dǎo)致DLin-MC3-DMA固定在膜表面。脂質(zhì)之間的相互作用減慢了兩個(gè)雙層膜體系的橫向擴(kuò)散,其中在含有DOPE的體系中觀察到擴(kuò)散速率的降低更為顯著。這也解釋利用磷脂酰乙醇胺構(gòu)建的脂質(zhì)體雙層膜(DOPE/DLin-MC3-DMA)具有較低的水滲透性,并且可能與其較差的轉(zhuǎn)染特性有關(guān)。

圖片1.png

圖1:分子動(dòng)力學(xué)模擬的脂質(zhì). (a) DLin-MC3-DMA. (b) 構(gòu)建DLin-MC3-DMA力場(chǎng)參數(shù)的部分. (c) DOPC,18:1 (Δ9 – cis) PC. (d) DOPE, 18:1(Δ9 – cis) PE.

模擬方法:

1. DLin-MC3-DMA模型的參數(shù)化

DLin-MC3-DMA模型參數(shù)的構(gòu)建參考了多不飽和磷脂相同的原理,由于LNP周?chē)沫h(huán)境通常為中性,因此設(shè)置總電荷為零以模擬中性條件下的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)的模型,MD模擬過(guò)程中并不會(huì)用到該化合物的電離狀態(tài)。

參考已有的用于多不飽和磷酸酯的SLipids力場(chǎng)(FF)推導(dǎo)DLin-MC3-DMA的力場(chǎng)參數(shù)。SLipids FF的一般形式為:

EFF = Ebonded + Enon-bonded

Ebonded = Eangles + Edihedrals + Ebonds + EUrey–Bradley

Enon-bonded = ELennard-Jones + ECoulomb

本研究中,重點(diǎn)是計(jì)算陽(yáng)離子脂質(zhì)的頭部基團(tuán)的電荷以及二面體參數(shù),而脂質(zhì)尾部的二面體參數(shù)可以直接調(diào)用SLipids FF中已知的不飽和脂質(zhì)中的參數(shù),脂質(zhì)尾部的電荷參考已有電荷進(jìn)行略微調(diào)整即可。

由于DLin-MC3-DMA的全原子量化計(jì)算所需的時(shí)間較長(zhǎng),計(jì)算機(jī)內(nèi)存要求較高,為了便于計(jì)算,使用高斯gaussian09軟件,利用B3LYP方法,CC-pVTZ基組以及RESP靜電勢(shì)約束方法對(duì)DLin-MC3-DMA的等效小模型(圖1b)進(jìn)行了電荷計(jì)算。在IEFPCM模型中,脂質(zhì)體的頭部基團(tuán)被放置在介電常數(shù)為78.4的可極化連續(xù)體系中,模擬溶劑效應(yīng)以及對(duì)電荷分布的誘導(dǎo)極化。具體電荷參數(shù)可在support文件中查閱。

在計(jì)算出部分原子電荷后,參考之前的SLipids FF相同的原理推導(dǎo)出新的二面體參數(shù)。二面角參數(shù)可以在support文件圖S2中查閱。與多不飽和脂質(zhì)的力場(chǎng)參數(shù)一樣,原始分子使用二階Møller–Plesset擾動(dòng)原理以及CC-pVDZ基組進(jìn)行優(yōu)化,在-180度到180度的區(qū)間里,設(shè)置10度為步長(zhǎng),保持其他自由度不變,通過(guò)圍繞二面角旋轉(zhuǎn)優(yōu)化分子。為了計(jì)算不同角度的構(gòu)象下的相對(duì)量子力學(xué)能量,采取了相互作用能的混合方法(HM-IE),關(guān)系是為:

ECCSD(T)/BBS = ECCSD(T)/SBS + ECCSD(T)/BBS − ECCSD(T)(SBS) ≈ ECCSD(T)/SBS + EMP2/BBS − EMP2/SBS

其中MP2表示二階Møller–Plesset擾動(dòng)原理,CCSD(T)是耦合簇理論中的耦合簇單雙和微擾三激發(fā)方法。SBS表示小基組(cc-pVDZ),BBS表示大基組(cc-pVQZ)。

完成高階量子化學(xué)計(jì)算后,所得值可以利用如下方程擬合二面體勢(shì):

Edihedral = (ECCSD(T)/BBS − EMD) − (ECCSD(T)/BBS − EMD)min

這里的EMD表示勢(shì)能的值,利用MD軟件,設(shè)置二面角的參數(shù)設(shè)置為0時(shí)可以得到EMD的值。二面體擬合的極限約為 2 kJ/mol。此外,新計(jì)算得到的二面體勢(shì)能用于新型陽(yáng)離子脂質(zhì),并在其力場(chǎng)文件中新增CTL6、NL和CL2原子類(lèi)型。其他 FF 參數(shù),例如鍵的參數(shù)、二面角的缺失值以及Urey-Bradley和角度參數(shù)均取自SLipids FF和CHARMM36 FF中已有的原子類(lèi)型(CTL5、NH3L 和 CTL2)

2. 分子模擬參數(shù)設(shè)置

模擬體系詳見(jiàn)表一,首先,構(gòu)建了兩種脂質(zhì)雙分子層,一種*由DOPC組成,一種*由DOPE構(gòu)成。每個(gè)雙層膜都由100個(gè)包含兩個(gè)磷脂的膜單體組成,一個(gè)處于直立,一個(gè)處于倒立(非鏡像對(duì)稱(chēng))。構(gòu)建好的兩種雙層膜用于構(gòu)建不同含量的DLin-MC3-DMA的膜,在選定好的位置(距離10A)的磷脂雙層膜中,刪除磷脂,插入優(yōu)化后的DLin-MC3-DMA分子代替。

表1 模擬體系組分

Lipid

PCs/PEs的數(shù)目

DLin-MC3-DMA數(shù)目

水分子數(shù)目(TIP3P

DOPC

190

10

8000

DOPC

170

30

8000

DOPE

190

10

8000

DOPE

170

30

8000

DOPC(pure)

200

0

8000

DOPE(pure)

200

0

8000

每個(gè)創(chuàng)建好的模擬系統(tǒng)在NPT系綜下平衡 300 ns,然后再平衡模擬300 ns。模擬體系采用 1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的壓力并且使用Berendsen恒壓器進(jìn)行壓力耦合,溫度設(shè)置恒定,保持在 298 K。算法采用牛頓運(yùn)動(dòng)方程式,設(shè)置步長(zhǎng)為 2 fs 的leap-frog,采用截?cái)喟霃綖?.2nm的范德華式Verlet截?cái)喾桨?。鍵長(zhǎng)使用 LINCS 算法進(jìn)行 12 次迭代限制。MD模擬和所得軌跡的分析是使用gromacs-4.6.7軟件完成的。

3. 動(dòng)力學(xué)模擬優(yōu)化設(shè)置

對(duì)DLin-MC3-DMA的4個(gè)體系進(jìn)行經(jīng)典的MD平衡模擬,確定能量最小化,體系達(dá)到穩(wěn)定。對(duì)于每個(gè)脂質(zhì)雙層,創(chuàng)建了5種不同的模擬起始條件。這些設(shè)置用于對(duì)每個(gè)脂質(zhì)雙層進(jìn)行 5 次平行的動(dòng)力學(xué)模擬。

廣義坐標(biāo)值 (CV) 被選為水分子質(zhì)心與脂質(zhì)雙層之間距離(見(jiàn)圖 2)。 高斯函數(shù)的高度為 1.2 kJ mol−1。 它們的寬度為 0.05 nm(參數(shù) σ),每 500 步(參數(shù) PACE 的值)沉積一次。 由于水分子的小尺寸,偏差因子γ被設(shè)置為10.0。

圖片2.png

圖2 初始動(dòng)力學(xué)模擬的廣義坐標(biāo)。 紅色小分子是水分子,青色分子是脂質(zhì)。 為清楚起見(jiàn),省略了所有其他水分子。 “CV”是坐標(biāo)值,“PMF”是自由能勢(shì)能面。

所有模擬都是在NVT系綜中,恒溫298K下,使用V-rescale熱浴進(jìn)行。牛頓運(yùn)動(dòng)方程的積分器是跳躍式的,采用時(shí)間步長(zhǎng)為 2 fs 和Verlet截?cái)喾桨?,其中截止半徑?nbsp;1.2 nm。 LINCS 算法被用于約束 12 次迭代的鍵長(zhǎng)。 用作MD模擬的軟件是 gromacs-4.6.7,用于自由能計(jì)算的 plumed-2.1.262。 每次模擬進(jìn)行150 ns。

結(jié)果與討論

3:系統(tǒng)截取的一幀快照:正面視圖和體系頂部的視圖。(a) DOPC和5%的DLin-MC3-DMA (b) DOPE和5%的DLin-MC3-DMA,(c) DOPC 和 15% 的 DLin-MC3-DMA 和 (d) DOPE 和 15% DLin-MC3-DMA。磷脂以青色顯示,磷以深石灰色球體顯示。DLin-MC3-DMA 以深藍(lán)色顯示。圖片采用VMD軟件繪制

在(a)和(b)中,分別在 DOPC 和 DOPE 膜中 DLin-MC3-DMA 的定位沒(méi)有觀察到顯著差異:DLin-MC3-DMA均位于靠近雙層膜表面的位置。 圖 3(c) 和 (d) 展示了磷脂含量較低的體系中,DLin-MC3-DMA 表現(xiàn)出偏好位于具有 DOPE 的膜表面,而在 DOPC 的情況下,DLin-MC3-DMA在很大程度上分布在雙層的中心。

表2 脂質(zhì)體中各組分的橫向擴(kuò)散速度(10-7cm2s-1

System

PCs/PEs的橫向擴(kuò)散速度

DLin-MC3-DMA的橫向擴(kuò)散速度

DOPC+5%DLin-MC3-DMA

1.15±0.40

1.01 ± 0.45

DOPC+15%DLin-MC3-DMA

0.94±0.40

0.65 ± 0.40

DOPE+5%DLin-MC3-DMA

1.00±0.45

1.15 ± 0.30

DOPE+15%DLin-MC3-DMA

0.66±0.45

0.55 ± 0.20

DOPC(pure)

0.98±0.42

-

DOPE(pure)

1.20±0.42

-

在含有DOPC的系統(tǒng)中,當(dāng)DLin-MC3-DMA的量增加時(shí),DOPC的擴(kuò)散以及DLin-MC3-DMA的擴(kuò)散都會(huì)減慢。 在含有 DOPE 的系統(tǒng)中,添加DLin-MC3-DMA比含有 DOPC的膜更顯著地降低了兩種脂質(zhì)的擴(kuò)散。 這可以被認(rèn)為是含有 DLin-MC3-DMA 和 DOPE的 LNP 在質(zhì)粒 DNA 遞送中沒(méi)有表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)染效率的原因,因?yàn)樵贒NA遞送過(guò)程中,橫向擴(kuò)散和膜融合是重要的因素。

脂質(zhì)體大小以及膜厚度

System

脂質(zhì)體面積

膜厚度

DOPC+5%DLin-MC3-DMA

70.98 ± 0.3

33.9 ± 0.1

DOPC+15%DLin-MC3-DMA

73.01 ± 0.3

33.1 ± 0.1

DOPE+5%DLin-MC3-DMA

63.52 ± 0.3

37.0 ± 0.1

DOPE+15%DLin-MC3-DMA

68.46 ± 0.4

33.7 ± 0.1

DOPC(pure)

69.00 ± 1.2

35.6 ± 0.1

DOPE(pure)

63.35 ± 1.0

38.2 ± 0.1

根據(jù)該表,含有DOPC的膜比含有DOPE的膜具有更高的脂質(zhì)體面積。 隨著DLin-MC3-DMA摩爾比的增加,每個(gè)脂質(zhì)的平均面積也會(huì)增加。 在使用DOPE的體系中,與純膜相比,每個(gè)脂質(zhì)的平均面積增長(zhǎng)高于使用DOPC的系統(tǒng)。 然而,表3中的值對(duì)于每個(gè)脂質(zhì)頭部基團(tuán)并不精確,因?yàn)镈Lin-MC3-DMA的脂質(zhì)尾部可能出現(xiàn)在表面,并且在某些幀中,整個(gè)陽(yáng)離子脂質(zhì)可能位于膜的中心,而不出現(xiàn)在雙層表面。 可以從每個(gè)脂質(zhì)的面積值得出的結(jié)論是,模擬框在DLin-MC3-DMA摩爾比為15 %時(shí)變得更寬。

圖片4.png

圖4質(zhì)量密度分布圖:(a) DOPC 和 (b) DOPE。 “Pure”代表僅含有磷脂的脂質(zhì)雙層,+5% DLin-MC3-DMA 意味著它是5%的MC3,+15% DLin-MC3-DMA 意味著它是 15% 的MC3.

圖4展示了模擬系統(tǒng)以及含有純磷脂的脂質(zhì)雙層的質(zhì)量密度分布。 隨著 DLin-MC3-DMA 濃度的增加,圖中 (a) 和 (b) 部分都表現(xiàn)出相同的質(zhì)量密度峰值向雙層中心移動(dòng)的趨勢(shì)。 這可以解釋為雙層變薄,因?yàn)橘|(zhì)量密度的最高值與脂質(zhì)頭部集團(tuán)的位置有關(guān)(計(jì)算的膜厚度值見(jiàn)表3)。 然而,為了獲得脂質(zhì)分子各個(gè)部分所在位置的準(zhǔn)確圖片,應(yīng)計(jì)算這些部分對(duì)質(zhì)量密度分布的貢獻(xiàn)。

圖片5.png

 5 質(zhì)量密度分布:(a)DOPC 和 5% 的 DLin-MC3-DMA,(b)DOPE 和 5% 的 DLin-MC3-DMA,(c)DOPC 和 15% 的 DLin-MC3- DMA 和 (d) DOPE 和 15% 的 DLin-MC3-DMA。粉紅色區(qū)域顯示磷脂的 PO4 頭部基團(tuán)的位置。 DLin-MC3-DMA (h) 和 DLin-MC3-DMA (t) 分別表示脂質(zhì)的頭部和尾部。在表示 DLin-MC3-DMA 結(jié)構(gòu)的圖像上,用于計(jì)算部分分子質(zhì)量密度的部分用紅色圓圈表示。為了獲得“可比較”的輪廓,僅從頭組中取出氮和兩個(gè)碳進(jìn)行計(jì)算,而從尾組中取出帶有氫的碳進(jìn)行計(jì)算。從圖中磷脂的結(jié)構(gòu)來(lái)看,PO4-基團(tuán)被認(rèn)為是脂質(zhì)頭部基團(tuán)的代表,而尾部則用尾部末端的CH3-基團(tuán)表示。 DLin-MC3-DMA 的部分以不同的方式著色:淺灰色 - 氫,深灰色 - 碳,藍(lán)色 - 氮和紅色 - 氧。黑色虛線表示 PO4 基團(tuán)質(zhì)量密度的最大值點(diǎn)。

圖5顯示了兩種脂質(zhì)的頭部和尾部對(duì)質(zhì)量密度分布的貢獻(xiàn)。在DLin-MC3-DMA的低濃度 (5 mol%) 可以觀察到兩種磷脂的分布差異(圖 5(a)和(b)):DLin-MC3-DMA 尾部的峰位置位于DOPE頭部區(qū)域,而在DOPC的情況下,該峰出現(xiàn)在磷脂尾部區(qū)域。 DLin-MC3-DMA的頭部基團(tuán)“更喜歡”位于 DOPC 和 DOPE 膜中的磷脂頭之間。

當(dāng)DLin-MC3-DMA的量為 15 mol%(圖 5(c)和(d))時(shí),DLin-MC3-DMA 尾部的峰移到 DOPE 頭部基團(tuán)的區(qū)域外。在 DOPC 膜中,與含有 5 mol% 胺脂的脂雙層相比,該峰的位置沒(méi)有改變。此外,與含有 DOPE 的脂質(zhì)雙層相比,位于 DOPC膜中心的DLin-MC3-DMA尾部數(shù)量更多。DLin-MC3-DMA的頭部“更喜歡”位于磷脂頭部的區(qū)域,但在含有 DOPC 的膜中,即使在脂雙層的中心也檢測(cè)到少量。 DLin-MC3-DMA 的這種位置與 Ramenzapour等人在模擬 DLin-KC2-DMA 以及POPC 和膽醇,處于中性 pH 值下觀察到的位置略有相似。

然而,脂質(zhì)并不是模擬系統(tǒng)中存在的分子。由于它們的運(yùn)動(dòng),水的運(yùn)動(dòng)會(huì)受到影響。水也可以滲透膜。在純磷脂雙層中,在雙層中心沒(méi)有檢測(cè)到大量的水,但DLin-MC3-DMA的添加改變了膜的滲透。例如,5 mol% 的量使 DOPE 脂質(zhì)膜具有滲透性,而在 DOPC 的情況下,滲透性更可忽略不計(jì)。在較高濃度的 DLin-MC3-DMA (15 mol%) 情況下,情況正好相反,含有DOPC的雙層的水滲透率高于含有 5 mol% 胺脂質(zhì)時(shí)的水滲透率,而對(duì)于含有 DOPE 的膜雙層中心水的質(zhì)量密度幾乎為零。

這些發(fā)現(xiàn)表明,在 DLin-MC3-DMA 的低濃度下,脂質(zhì)尾部甲基的質(zhì)量密度峰值出現(xiàn)在 PO4 基團(tuán)區(qū)域內(nèi)(圖 5(b))。這種少量疏水部分的位置可能是質(zhì)子轉(zhuǎn)移中斷的原因,因?yàn)樵诩兞字p層中,根據(jù) Brändén 等人和 Yamashita 等人的說(shuō)法,磷酸基團(tuán)具有“質(zhì)子收集效應(yīng)”此外,磷脂酰堿頭部基團(tuán)周?chē)乃肿优c磷脂酰乙醇胺頭部基團(tuán)周?chē)乃肿記](méi)有相同的優(yōu)先取向。因此,與具有 DOPC 的脂質(zhì)雙層相比,外來(lái) CH3 基團(tuán)的存在更能導(dǎo)致 DOPE 膜中的孔形成。

在含有 DOPC 的脂質(zhì)雙層中,當(dāng)含有 15 mol% 時(shí),隨著DLin-MC3-DMA濃度的增加,水滲透率略高。這與少量 DLin-MC3-DMA 的頭部基團(tuán)位于由DOPC組成的膜的中心有關(guān)(圖 5(c))。這些頭部基團(tuán)可以起到水分子通過(guò)膜的“轉(zhuǎn)運(yùn)體”的作用。在含有等量 DLin-MC3-DMA 的DOPE的脂質(zhì)雙層中,水滲透的降低可以通過(guò) DLin-MC3-DMA 脂質(zhì)尾部位置的輕微變化來(lái)解釋。DLin-MC3-DMA的甲基最大質(zhì)量密度分布向 DOPE 的羰基轉(zhuǎn)移,這可以在該區(qū)域產(chǎn)生疏水層并防止水進(jìn)入膜。

我們只能推測(cè)這些關(guān)于分子不同部分對(duì)質(zhì)量密度的影響,在較高濃度的DLin-MC3-DMA下緩慢的橫向擴(kuò)散可能與強(qiáng)相互作用有關(guān),也可能與磷脂的頭部基團(tuán)有關(guān)。特別是,在具有 DOPE脂質(zhì)尾部的膜中,DLin-MC3-DMA似乎與磷脂頭部相關(guān)聯(lián)。為了闡明這一點(diǎn),我們計(jì)算了兩個(gè)組分之間的徑向分布函數(shù)(RDF)。

圖片6.png

 6 磷脂和 DLin-MC3-DMA 頭團(tuán)中原子對(duì)之間的 RDF。 (a) 來(lái)自 DLin-MC3-DMA 的氧與來(lái)自 DOPC 的 CH3 基團(tuán)的氫/來(lái)自 DOPE 胺基團(tuán)的氫之間的 RDF。 (b) 來(lái)自 DLin-MC3-DMA 的氧與來(lái)自 DOPC/DOPE 中甘油基團(tuán)的 CH2 基團(tuán)的氫之間的 RDF。 部分磷脂按以下方式著色:青色-碳,藍(lán)色-氮,黃色-磷,紅色-氧,灰色-氫。 DLin-MC3-DMA 的部分以不同的方式著色:淺灰色-氫,深灰色-碳,藍(lán)色-氮和紅色-氧。

圖片7.png

 7 磷脂頭部和DLin-MC3-DMA尾部原子對(duì)之間的RDF。(a)DLin-MC3-DMA中標(biāo)記為“a”的碳與來(lái)自DOPC的CH3基團(tuán)的氫/來(lái)自DOPE的胺基團(tuán)的氫之間的RDF。 (b) DLin-MC3-DMA 中標(biāo)記為“b”的碳與來(lái)自 DOPC 的 CH3 基團(tuán)的氫/來(lái)自DOPE的胺基團(tuán)的氫之間的 RDF。(c) DLin-MC3-DMA 中標(biāo)記為“c”的碳與來(lái)自 DOPC 的CH3基團(tuán)的氫/來(lái)自 DOPE 的胺基團(tuán)的氫之間的 RDF。(d) DLin-MC3-DMA 中標(biāo)記為“d”的碳與來(lái)自 DOPC 的 CH3 基團(tuán)的氫/來(lái)自 DOPE 的胺基團(tuán)的氫之間的RDF。部分磷脂按以下方式著色:青色-碳,藍(lán)色-氮,黃色-磷,紅色-氧,灰色-氫。DLin-MC3-DMA的部分以不同的方式著色:淺灰色-氫,深灰色-碳,藍(lán)色-氮和紅色-

 

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